Гематологическое исследование

По изменениям, происходящим в крови, можно судить о патологических процессах, протекающих в организме рыб. Результаты исследований крови с учетом клинических, эпизоотологических и патологоанатомических данных позволяют уточнить диагноз болезни (табл. 12, 13, 14, 15).

Кровь для исследования берут пастеровской пипеткой из сосудов гемального канала хвостового стебля. Место взятия обрабатывают 70%-ным спиртом, просушивают ватным тампоном.

Определение количества эритроцитов и лейкоцитов. Кровь набирают в смеситель меланжера, используемого для подсчета эритроцитов млекопитающих, до метки 0,5 или 1 и насасывают жидкость для окрашивания и разведения крови до метки 101 (раствор А: нейтральрот - 25 мг; натрий хлористый - 0,6 г, вода дистиллированная-100 мл; раствор Б: кристаллвиолет - 12 мг, натрий лимоннокислый - 3,8 мг, формалин - 0,4 мл, вода дистиллированная - 100 мл). Раствор А набирают до половины расширения смесителя, раствор Б - до метки 101. (Готовят эти растворы непосредственно перед исследованием, хранить можно в холодильнике не более недели.) Под действием растворов ядра лейкоцитов окрашиваются в фиолетово-красный цвет, а цитоплазма - в розовый. В эритроцитах ядра окрашиваются в синий цвет.

После наполнения снимают резиновую трубку со смесителя, захватывают его между большим и средним пальцами и сильно встряхивают 2-5 мин, после чего выпускают из капилляра 3 капли жидкости, а 4-й каплей заряжают счетную камеру.

Принцип метода сводится к подсчету форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов) в камере Горяева. Сначала под малым увеличением микроскопа находят сетку и устанавливают равномерность распределения клеток, а затем подсчитывают их. Эритроциты считают в 5 квадратах (80 малых), расположенных по диагонали камеры Горяева. В каждом малом квадрате учитывают эритроциты, находящиеся внутри него, и те, которые касаются или лежат на его верхней и левой линиях.

Количество эритроцитов определяют по формуле

где m - общее количество клеток в 80 квадратах; γ - степень разведения крови; Х - число эритроцитов в 1 мкл.

Лейкоциты подсчитывают в 25 больших квадратах, разделенных на малые (400 малых), и определяют по формуле

где m - общее количество лейкоцитов; γ - степень разведения крови; Х - число лейкоцитов в 1 мкл; 400 - число просмотренных малых квадратов.

Выведение лейкоцитарной формулы. У рыб различают следующие виды лейкоцитов: лимфоциты, моноциты, базофилы, нейтрофилы, эозинофилы (цв. табл. II). Некоторые авторы выделяют группу полиморфноядерных лейкоцитов.

Лимфоциты - небольшие клетки, немного меньше эритроцитов. Почти вся клетка заполнена ядром, цитоплазма видна в виде узкого ободка вокруг ядра. По Романовскому ядро окрашивается в фиолетово-розоватый цвет, цитоплазма - в голубоватый.

Моноциты - самые крупные клетки, ядро бобовидное, расположено эксцентрично, цитоплазма вакуолизирована, зернистость отсутствует.

Нейтрофилы - круглые клетки, имеют овальное, палочковидное или сегментированное ядро, расположенное у края клетки. В зависимости от возраста и формы ядра клетки разделяют на миелоциты, юные, палочкоядерные и сегментоядерные. Зернистость в цитоплазме окрашивается по Романовскому - Гимзе в фиолетово-розовый цвет.

Эозинофилы - по морфологии сходны с нейтрофилами. В цитоплазме находятся крупные многочисленные зернышки розового цвета.

Базофилы отличаются наличием в цитоплазме зерен фиолетового цвета.

Высушенный и фиксированный метанолом или спирт-эфиром (1:1) мазок крови окрашивают краской Романовского - Гимза. Раствор краски предварительно разводят нейтральной дистиллированной водой (1-2 капли на 1 мл воды). Разведенную краску подслаивают под предметное стекло, положенное мазком вниз, или красят мазки в контейнерах. В зависимости от температуры воздуха и качества краски мазок окрашивают 30-60 мин. После окраски препарат быстро ополаскивают водой, высушивают на воздухе, просматривают под микроскопом с иммерсионным объективом. Обычно просчитывают 200 лейкоцитов общепринятым методом.

Определение содержания гемоглобина.

Метод Сали. В градуированную пробирку гемометра Сали до метки 2 пипеткой наливают децинормальный раствор соляной кислоты. Капиллярной пипеткой набирают кровь до метки 20 мкл и вносят в пробирку с соляной кислотой. Затем перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 5 мин. После чего в пробирку по каплям доливают дистиллированную воду, перемешивают и подбирают цвет рабочего раствора до совпадения с цветом жидкости в стандартных пробирках.

Количество гемоглобина крови отсчитывают по нижнему мениску на градуированной пробирке. Выражают в г%.

Фотометрический метод. Мерной пипеткой в пробирку осторожно наливают 5 мл трансформирующего раствора (бикарбонат натрия - 1 г, красная кровяная соль - 0,2, цианистый калий или натрий - 0,05 г, дистиллированная вода - до 1 л). Пипеткой от гемометра Сали добавляют 20 мкл крови, промывая ее раствором путем попеременного вдувания и выдувания. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 20 мин в холодильнике. Затем раствор из пробирки наливают в кюветы ФЭК и, используя зеленый светофильтр, проводят измерения. Расчет гемоглобина (г/л) производят по формуле Х=D₅₄₀ ·367,1 г/л, где D₅₄₀ - показания ФЭК; 367,1 - коэффициент перерасчета.