Генетика, стимуляция созревания и консервация половых продуктов

Основы физиолого-биохимического и генетического мониторинга объектов марикультуры (Канд. биол. наук Чихачев А.С., АзНИИРХ)

Для эффективного функционирования марихозяйств необходим постоянный контроль за функциональным состоянием и генетической структурой стад объектов выращивания. Многолетние наблюдения ученых отдела генетико-биохимического мониторинга АзНИИРХа за состоянием ряда объектов марикультуры и пастбищного разведения в Азово-Черноморском бассейне: осетровых и их гибридов, пиленгаса, леща, судака, тарани калкана и мидии в сочетании с анализом большого количества литературных данных позволили отобрать ряд достаточно универсальных и информативных физиолого-биохимических и генетических методов, которые объединены в комплекс из пяти основных блоков:

1. Мониторинг общего функционального состояния объектов культивирования. Наиболее распространенные биохимические тесты функционального состояния гидробионтов - определение содержания белка и липидов в сыворотке и гемоглобина в крови, содержания влаги и жира в мышечной ткани. Диагностическая ценность этих показателей подтверждена большим количеством экспериментальных работ, но не всегда достаточна для решения конкретных задач в марикультуре. Предлагается дополнить этот набор следующими показателями: соотношением ДНК, РНК и белка в тканях - тест на интенсивность биосинтеза белка, пролиферацией клеток в тканях и полноценностью используемых кормов, гистологическим состоянием печени - тест на полноценность питания, содержанием холестерина в сыворотке крови - тест на половое созревание, формулой крови и гематокритом - тест на интенсивность кроветворения, гистофизиологией щитовидной и интерреналовой желез - определение метаболической активности.

2. Мониторинг состояния репродуктивной системы. Состояние репродуктивной системы оценивается с помощью гистофизиологических методов, по результатам естественного или искусственно стимулированного нереста и по некоторым биохимическим показателям гонад и сыворотки крови. Гистологически оценивается степень зрелости гонад, темп и синхронность развития ооцитов и сперматоцитов. При этом измеряют диаметр клеток, определяют количество оогоний, прото- и трофоплазматических ооцитов. Описывают морфологические изменения в строении гонад, наличие или отсутствие дегенеративных изменений, степень резорбции.

Комплекс этих показателей опробован на пиленгасе - новом объекте марикультуры и азовских осетровых. Многолетние наблюдения показали высокую диагностическую и информационную ценность этих показателей. Установлено повышение частоты дегенеративных процессов в гонадах осетровых рыб с 9 % в 1979 г. до 27 % в 1989. При искусственном разведении осетровых до 40 % потерь личинок обусловлено дегенеративными изменениями в икре. Новый диагностический тест на качество икры - определение уровня сиаловых кислот в сыворотке крови. В морской и речной периоды жизни у осетровых описаны различные аномалии, связанные с задержкой в развитии гонад, ранним угасанием воспроизводительной функции, нарушением ритма размножения, изменением плодовитости. Рыбы заводского происхождения не отличаются от рыб естественного нереста по темпам и срокам полового созревания. Изучена динамика полового созревания производителей пиленгаса при формировании его маточного стада.

Из многих биохимических показателей, характеризующих состояние репродуктивной системы, наиболее информативны содержание влаги и белка в ооците и количество белка и холестерина в сыворотке крови. Важную роль в половом созревании играют половые гормоны. Радиоиммунологическим методом изучена динамика эстрадиола при созревании осетровых рыб. Одновременно с половыми гормонами рекомендуется определять содержание в сыворотке кальция, так как оно коррелирует со степенью зрелости гонад.

3. Мониторинг реакции на неблагоприятные воздействия. Для оценки стрессового влияния на объекты марикультуры предложено гистологическое изучение функциональной активности щитовидной и интерреналовой желез. Активность щитовидной железы оценивают по степени вакуолизации и зрелости коллоида, высоте клеток тиреоидного эпителия. Активность интерреналовой железы определяют по изменению диаметра ядер и степени вакуолизации цитоплазмы клеток. Гиперактивность и истощение этих желез - показатели отрицательного влияния на рыб. Определение формулы крови и патологических форменных элементов позволяет быстро выявить токсическое действие поллютантов, наличие воспалительных процессов, ухудшение газового режима.

Неспецифическими биохимическими тестами глубины повреждающего действия поллютантов являются методы определения состава липидных и белковых компонентов мембран и активность мембранных ферментов цикла Кребса, гликолиза и пентозо-фосфатного пути. Важное диагностическое значение имеет определение активности кислых гидролаз и ее соотношение внутри и вне лизосом. Информативны биофизические методы оценки интенсивности свободно-радикальных процессов, перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности в тканях объектов марикультуры.

Большей специфичностью, позволяющей установить природу повреждающего фактора, обладает достаточно узкий набор показателей. Для диагностики интоксикации фосфоорганикой используют определение активности ацетилхолинэстеразы в сыворотке и тканях рыб. Повреждающее действие ионов тяжелых металлов можно диагностировать по содержанию в тканях металлотионеинов. Уровень загрязнения среды обитания и кормов органическими поллютантами: полихлорированными бифенилами, ХОП, ФОС, ароматическими аминами, фенолами, полициклическими углеводородами можно тестировать, определяя активность микро-сомальных монооксигеназ в печени. Эти ферменты ответственны за метаболическое обезвреживание органических токсикантов.

Наиболее информативные показатели, отражающие воздействие на мидий токсикантов, - биохимические показатели гемолимфы: содержание белка, холестерина, молочной и пировиноградной кислот. Интегральный показатель токсического действия - частота встречаемости деформированных раковин моллюсков. Этот показатель изменяется от 3 % в чистых районах до 50 % в районах, загрязненных нефтепродуктами и тяжелыми металлами. Мидии - активные накопители ряда поллютантов, поэтому целесообразно использовать их ткани для анализа Содержания загрязняющих веществ в районах размещения аквахозяйств.

4. Мониторинг мутагенности среды и выращенной продукции. Для выявления уровня мутагенности и обеспечения генетической безопасности продукции марихозяйств предложен набор методов, включающий тест Эймса, учет хромосомных аберраций в проростках лука, эпителии личинок осетровых и бычков, микроядерный тест в эритроцитах карпа и аквариумных рыб, тератологический анализ эмбрионов. Этот комплекс позволяет тестировать все виды мутаций: генные, хромосомные и геномные. Он апробирован на донных отложениях из мест расположения марихозяйств, автомобильных покрышках, Используемых для строительства искусственных рифов, тканях мидий, выращиваемых на коллектрах.

5. Мониторинг генетической структуры культивируемых стад и воспроизводимых популяций. Для изучения генетической структуры популяций и искусственно формируемых стад используется комплекс методов биохимической генетики, позволяющих количественно оценить уровень генетической изменчивости организмов на основании исследования полиморфизма ферментных и белковых неферментных локусов. Методом диск-электрофореза в блоках полиакриламидного геля фракционируют продукты действия изучаемых локусов и с помощью специфической окраски определяют фенотипы особей. Математическими методами популяционно-генетического анализа на персональных компьютерах и ЭВМ изучается степень дифференцированности природных популяций, а с помощью моделирования прогнозируются возможные изменения в них. Исходными данными для математической обработки служат частоты фенотипов и аллелей и показатели гетерозиготности.

Для изучения внутрипопуляционной структурированности видов с низкой генетической изменчивостью локусов, доступных для электрофоретического типирования, используют анализ морфогенетических признаков с последующей обработкой его результатов методами многомерной статистики: дискриминантным, факторным или кластерным.

Освоение комплекса неспецифических и специфических показателей с машинной обработкой полученных данных позволит выявить причинно-следственные связи влияния загрязнения и условий выращивания на функциональное состояние гидробионтов, оптимизировать условия функционирования марихозяйств для повышения их эффективности и получения экологически чистой продукции.

Необходимо отметить, что первым этапом в развитии марикультуры должна быть экологическая экспертиза предполагаемых мест строительства марихозяйств, причем ее важнейшим аспектом должны стать эксперименты по выращиванию в них небольших опытных партий объектов культивирования и тест-объектов с тщательным и всесторонним анализом их функционального состояния, репродуктивной системы, уровня генетических нарушений и накопления поллютантов в разных тканях. Только после Проведения этих работ в районах, где были получены положительные по всем параметрам результаты, следует начинать строительство марихозяйств. При их промышленном функционировании комплекс методов мониторинга функционального и генетического состояния должен применяться постоянно для контроля за процессом получения посадочного материала, выращивания и качества продукции.